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        蛋白質表達、分離、純化步驟

        發布時間:2022-12-09      點擊次數:651
          蛋白質表達、分離、純化可以:
         
          (1)探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理;
         
          (2)供作結構與功能的研究;
         
          (3)作為催化劑、營養劑等。
         
          實驗步驟:
         
          一:材料準備
         
          1. 實驗材料:大腸桿菌 BL21、LB 液體培養基、氨芐青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸餾水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉
         
          2. 實驗儀器:搖床、離心機、層析柱、離心管、移液槍、槍頭盒、燒杯、玻璃棒
         
          二:實驗操作
         
          1. 試劑準備
         
          2. 獲得目的基因
         
         ?、?PCR 方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR 循環獲得所需基因片段。
         
         ?、?通過 RT-PCR 方法:用 TRIzol 法從細胞或組織中提取總 RNA,以 mRNA 為模板,逆轉錄形成 cDNA 第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行 PCR 循環獲得產物。
         
          3. 構建重組表達載體
         
         ?、?載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收 Kit 或凍融法回收載體大片段。
         
         ?、?PCR 產物雙酶切后回收,在 T4DNA 連接酶作用下連接入載體。
         
          4. 獲得含重組表達質粒的表達菌種
         
         ?、?將連接產物轉化大腸桿菌 DH5α,根據重組載體的標志(抗 Amp 或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。
         
         ?、?測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確, 進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
         
         ?、?以此重組質粒 DNA 轉化表達宿主菌的感受態細胞。
         
          5. 氯霉素?;D移酶重組蛋白的誘導
         
         ?、?接種含有重組氯霉素?;D移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液體培養基中(含 100 ug/mL 氨芐青霉素),37 ℃ 震蕩培養過夜。
         
         ?、?按 1∶50 或 1:100 的比例稀釋過夜菌,一般轉接 1 mL 過夜培養物于 100 mL(含 100 ug/mL 氨芐青霉素)LB 液體培養基中,37℃ 震蕩培養至 OD600 = 0.6 - 0.8(最好 0.6,大約需 3 h)。取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
         
         ?、?對照組不加誘導劑,實驗組加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/l,37℃ 繼續培養 1-3 h。
         
         ?、?12 000 rpm 離心 10 min,棄上清,菌體沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。
         
          6. 氯霉素?;D移酶重組蛋白的分離、純化
         
         ?、?NTA 層析柱的準備:在層析柱中加入 1 mL NTA 介質,并分別用 8 mL 去離子水,8 mL 上樣緩沖液洗滌。
         
         ?、?重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入 5 mL 上樣緩沖液, 用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品 60 min,4℃ 12000 rpm 離心 30 min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取 10 ul 上清樣品用于 SDS-PAGE 分析。
         
         ?、?上清樣品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱,收集流出液,取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
         
         ?、?洗脫雜蛋白:用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱,直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脫液,約 3-4 h,取 10 ul 洗脫開始時的樣品用于 SDS-PAGE 分析。
         
         ?、?洗脫目標蛋白:用 Elution Buffer 洗柱,收集每 1 mL 級分,分別取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
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